Abstract

SO.04.09

Phänotypische Charakterisierung von ex-vivo-expandierten epithelialen Stammzellen der Mundschleimhaut zur Rekonstruktion der Hornhautoberfläche

Kruse F. E.¹, Nkenke E.², Blazejewska E.¹, Hofmann-Rummelt C.¹, Schlötzer-Schrehardt U.^1
1Augenklinik mit Poliklinik, ²Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgische Klinik, Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen

Ziel: Die Transplantation autologer epithelialer Stammzellen der Mundschleimhaut könnte eine Alternative zur allogenen Transplantation bei Patienten mit bilateraler Limbusstammzellinsuffizienz darstellen (Nakamura et al. 2003). Zielsetzung dieser Studie war die phänotypische Charakterisierung ex-vivo-expandierter Stammzellen der Mundschleimhaut unter verschiedenen Kulturbedingungen zur Rekonstruktion der Hornhautoberfläche.
Methode: Bukkale Mundschleimhaut-Biopsate wurden von 10 Patienten im Rahmen kieferchirurgischer Eingriffe gewonnen und als Explantat- oder Einzelzellsuspensions-Kulturen auf Fibringelen oder Amnionmembranen mit 3T3-Feederzellen in DMEM/F12 expandiert. Epitheliale Stammzell-Populationen wurden mittels „Colony-forming assays“ auf 3T3-Zellen angereichert. Die phänotypische Charakterisierung der Epithelschichten erfolgte mittels Licht- und Elektronenmikroskopie sowie immunhistochemischer Analyse Hornhaut-spezifischer Differenzierungs- (K3/K12) und Stammzellmarker (ABCG2, p63, Integrin-b1).
Ergebnisse: Konfluente, Hornhautepithel-ähnliche Zellschichten aus 3-5 Zelllagen konnten sowohl mittels Einzelzellsuspensionen als auch Explantat-Kulturen auf Fibringelen und Amnionmembran nach 2-3 Wochen erzeugt werden. Etwa 0,2-0,3% der auf 3T3-Zellen ausgesäten Keratinozyten bildeten stabile grosse Kolonien in Form von Holoklonen, die als konfluente Schichten auf Trägersubstraten subkultiviert werden konnten. Elektronenmikroskopisch zeigten sich gut differenzierte Zellen mit prominenten Tonofilamenten, Desmosomen und Hemidesmosomen in den primären Epithelschichten, jedoch weniger differenzierte Zellen in den subkultivierten Schichten. Immunhistochemisch konnten zahlreiche K3/K12-positive Zellen sowie ABCG2-, p63- und Integrin-b1-positive Zellen mit Stammzellcharakter in den kultivierten Epithelschichten identifiziert werden.
Schlussfolgerungen: Epithelschichten aus Stammzellen der Mundschleimhaut mit phänotypischen Charakteristika von Hornhautepithel lassen sich auf Fibrin oder Amnionmembran mit verschiedenen Methoden expandieren und zur autologen Transplantation bei Patienten mit bilateraler Limbusstammzellinsuffizienz einsetzen.

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