Abstract

SO.04.12

Erhalt des limbalen Stammzell-Phänotyps durch optimierte Kulturbedingungen

Schlötzer-Schrehardt U., Blazejewska E., Kruse F. E.
Augenklinik mit Poliklinik, Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen

Ziel: Der Erfolg einer Transplantation ex vivo-expandierter kornealer Stammzellen beruht auf dem Erhalt der Stammzelleigenschaften in Kultur, was jedoch mit den gebräuchlichen Verfahren einer Explantat-Kultur nicht erreicht wird. Daher untersuchten wir klonogenes Potential und Effekte verschiedener Kulturbedingungen auf klonales Wachstum und Differenzierungsgrad von limbalen Stammzellen.
Methode: Epithelzellen wurden aus Limbusexzisaten von 20 menschlichen Spenderaugen enzymatisch isoliert, auf einer 3T3 Feeder-Zellschicht ausgesät und für 2-4 Wochen kultiviert. Der Einfluss verschiedener Kulturmedien (MCDB151, DMEM/F12, PCT, KSFM) sowie verschiedener Serum- und Wachstumsfaktor-Konzentrationen auf Koloniedichte und -grösse wurde quantitativ analysiert. Die phänotypische Charakterisierung der Stammzell-Klone erfolgte mittels Licht- und Elektronenmikroskopie sowie mittels immunhistochemischer Analyse verschiedener Stammzell- (ABCG2, Nestin, p63) und Differenzierungsmarker (K3/K12).
Ergebnisse: Etwa 0,3-0,4% der Limbusepithelzellen bildeten stabile grosse Kolonien in Form von Holoklonen auf der Feeder-Zellschicht. Eine 2-wöchige Kultivierung in DMEM/F12, PCT und KSFM ergab eine signifikant höhere Koloniedichte und -grösse als in MCDB151, das erst nach 4-wöchiger Kultivierung zur Bildung von Holoklonen führte. Zugabe von 10% FCS und 5 ng/ml hEGF zum Kulturmedium führte zu einer signifikanten Zunahme des klonalen Wachstums. Elektronenmikroskopische und immunhistochemische Analysen der Holoklone zeigten Monolayer kleiner, relativ undifferenzierter Zellen mit fokalen Stratifizierungsinseln in MCDB151, jedoch weitgehend mehrschichtige und differenzierte Zelllagen in DMEM/F12, PCT und KSFM. Eine serumfreie Subkultivierung der Stammzell-Klone als konfluente Monolayer auf transplantationsfähigen Substraten, wie Fibringelen oder Amnionmembranen, war möglich.
Schlussfolgerungen: Optimierte Kulturbedingungen können die Anreicherung limbaler Stammzellen fördern und die langfristige Prognose einer okulären Oberflächenrekonstruktion bei Patienten mit Limbusstammzellinsuffizienz verbessern.

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